稳建株构建概述

稳转株构建是指通过特定的实验方法，将外源基因稳定地整合到细胞染色体中，从而获得能够在细胞分裂过程中持续表达外源基因的细胞株。稳转株构建是生物医学研究中的一项基本技术，广泛应用于基础研究、药物开发、生物制品生产等领域。

实验目的

1. 持续表达特定的蛋白质，用于功能研究或蛋白生产。

2. 建立细胞模型，用于疾病机制研究或药物筛选。

3. 生产重组蛋白或抗体。

常见类型

1. 病毒载体介导的基因转移：

逆转录病毒：将目的基因插入逆转录病毒载体，通过病毒感染将基因整合到宿主细胞基因组中。

慢病毒：类似于逆转录病毒，但能感染非分裂细胞，转染效率较高。

腺病毒：通常不整合到宿主基因组，但能高效转染多种细胞类型。

2. 非病毒载体介导的基因转移：

质粒DNA转染：使用电穿孔、脂质体介导等方法将质粒DNA直接转入细胞。

基因枪：利用高速粒子将DNA直接打入细胞核。

3. CRISPR/Cas9技术：

通过设计特定的sgRNA（单链引导RNA）和Cas9蛋白，实现基因组的精确编辑和插入。

实验步骤

1. 选择目的基因：确定需要插入的基因片段，并设计合适的表达载体。

2. 构建表达载体：将目的基因克隆到适当的表达载体中，如质粒、病毒载体等。

3. 转染细胞：使用适当的转染方法将表达载体导入目标细胞。

4. 筛选稳转细胞：

抗生素筛选：如果载体含有抗性基因，可以使用相应的抗生素进行筛选。

荧光筛选：如果载体含有荧光蛋白基因，可以通过荧光显微镜筛选表达荧光的细胞。

功能性筛选：根据目的基因的功能进行筛选，如抗体的特异性结合能力。

5. 克隆和扩增：挑选单个稳转细胞克隆并进行扩增培养。

6. 验证：

RT-PCR：检测目的基因的转录水平。

Western blot：检测目的蛋白的表达。

功能测试：验证目的蛋白的功能。

注意事项

1. 选择适合宿主细胞和目的基因的载体和转染方法。

2. 确保转染效率和稳转细胞株的稳定性。

3. 进行充分的筛选和验证，确保获得单克隆稳转细胞株。

提供信息

1. 客户是否提供细胞；

2. 客户是否提供病毒；

3. 常规需要RT-PCR检测，客户是否需要。

测试价格

1. 细胞株购买400，细胞适应性培养300-400；

2. 细胞STR鉴定800；

3. siRNA设计合成（3+1）3000，最佳靶序列筛选1500；（过表达载体构建不需要这个费用）

4. shRNA病毒合成包装（滴度10^8）,1条目的+1个NC 3280；过表达病毒合成包装（滴度10^8）,1条目的+1个NC 5280；

5. 稳转株筛选及验证（RT-qPCR，若WB需客户提供抗体） 5000。